pmid:31455769

doi:10.1038/s41467-019-11754-0

实验材料

实验动物为SPF级BALB/c小鼠，感染症状等与性别无明显关系，感染优选３周龄小鼠。

实验使用毒株为ATCC来源PVM毒株（VR-25）。

实验环境

ABSL－２实验室，

使用负压IVC饲养动物

使用AII型生物安全柜更换动物垫料，并进行感染等操作。

实验操作规程：

病毒扩增：在BSL-2实验室进行病毒扩增，并使用TCID50法测定病毒滴度

使用1,000TCID50／只动物进行滴鼻感染

监测动物临床表征变化

监测动物死亡率

动物处理伦理：

动物感染实验，动物的痛苦不可避免，应按照伦理审查确定研究的科学性，并根据研究需要减少动物的使用。

1、 鉴定、病原学检查信息

使用肺组织定量PCR的方法可以进行组织病毒滴度的评价。测定方法参考团体标准《实验动物PVM的核酸检测方法》，或使用文献支持的下列引物：

PVM -F 5′-GCCTGCATCAACACAGTGTGT-3′;

PVM -R 5′-GCCTGATGTGGCAGTGCTT-3′

测试需和组织内参基因表达做均一化处理，如使用GAPDH做内参。

表达水平的结果如下图所示：

图示：小鼠感染PVM７天后肺组织PVM RNA水平（参比GAPDH做均一化处理）。

C:未感染对照，IN-C：感染对照，IN-A，IN-F：两个处理组。

表达水平还可经免疫组化进行分析，使用PVM大鼠免疫血清进行小鼠肺组织PVM免疫组化染色，和上图对应的示例图如下：

小鼠感染PVM病毒后组织PVM免疫组化。

A:未感染对照，Ｂ：感染对照，Ｃ，Ｄ：两个处理组。

2、 表型分析

３周龄BALB/c小鼠感染PVM后，可见体重较对照组体重下降，如下图所示：

图示：BALB/c ３周龄小鼠感染PVM体重变化

Control：未感染动物；NS：生理盐水处置感染动物；GL：某药物治疗组。

感染动物在感染３日后出现竖毛，弓背等症状。严重者体重下降，出现行动迟缓，耳及尾部可见紫绀，震颤。如下图所示：

3、 病理表型

动物感染３~７日，肺组织可见充血水肿，组织病理可见肺间隔增宽，肺组织内血管充血，出血，偶见炎细胞浸润。如下图所示。

PVM为低于人间传染病名录三级安全风险的病原，人类感染的风险低，但不排除对免疫功能缺陷者的致病性。

PVM是啮齿类实验动物必须排除的病原体，对动物有致病性。会干扰其他实验研究。

鉴于此，此感染实验必须在BSL-2级以上的生物安全实验室进行病原学实验，在ABSL-2实验室进行动物实验。

１. 病毒滴度的变化：接种病毒后，动物肺组织PVM RT-PCR检测可检出病毒，病毒滴度在感染后３天达到高峰，并可维持至７日，随后滴度下降。

２. 感染动物体重较之未感染动物体重下降，动物多出现竖毛，弓背等症状。严重者体重下降，行动出现迟缓，耳及尾可见紫绀，震颤，处于濒死状态。用于药效评价实验时，应控制感染剂量，降低因感染出现的急性死亡（４日内）。６~７日的死亡率可作为药效评价的指标。

３. 病理损伤以充血、出血、肺组织水肿以及炎细胞浸润为标准，应测定肺间隔，以及肺通气水平，进而评估肺呼吸能力。

４. 炎症因子重点关注IL-1β，IL-6，IL-18，MCP-1，IFN-γ等。

进行人类RSV 肺炎感染研究，国内外推荐使用PVM做替代实验。PVM的毒株不同，实验动物的品系不同，动物的临床表型也会存在差异。本模型的表型与国外进行的模型研究表型相似，在急性期的死亡率较低，有较长的临床治疗的窗口，可用于免疫治疗的疗效评价。